土壤微生物多样性检测：从样品采集到群落 

一、检测标准与方法选择  

1.核心标准依据  

方法类型标准号适用场景检出限/分辨率  

传统培养法HJ1015-2019可培养微生物计数10CFU/g  

高通量测序法EPAMethod16S微生物群落结构解析种水平分辨率（16SrRNA基因）  

宏基因组测序GB/T38465-2020功能基因与代谢通路分析菌株水平鉴定  

2.方法对比与选择  

16SrRNA基因测序：性价比高，适合大规模群落结构调查（推荐V4区引物515F/806R）  

宏基因组测序：揭示功能潜力，但成本较高（建议用于污染场地修复评估）  

二、样品采集与前处理关键技术  

1.无菌采样流程  

采样工具：灭菌离心管（50mL）、不锈钢铲（75%酒精擦拭消毒）  

采样方法：五点混合采样法，每点采集0-10cm表层土，混合后过2mm筛  

保存条件：液氮速冻后-80℃保存（避免DNA降解），采样后24h内完成提取  

2.DNA提取优化  

试剂盒选择：PowerSoil®DNAIsolationKit（腐殖质去除效果佳）  

提取步骤：  

1.0.5g土壤加入玻璃珠，涡旋振荡30s破碎细胞  

2.加入C1溶液（抑制腐殖酸），65℃水浴10min  

3.磁珠法纯化，洗脱体积50μL  

三、检测技术与仪器条件  

1.16SrRNA基因测序    

PCR扩增：  

引物：515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）  

反应体系：2×TaqMasterMix25μL，引物各1μL，DNA模板5μL  

循环条件：95℃（3min）→30×[95℃（30s）→55℃（30s）→72℃（45s）]  

测序平台：IlluminaMiSeq（2×300bp双端测序）   

2.数据分析流程  

1.原始数据质控：Trimmomatic过滤低质量序列（Q30≥90%）  

2.OTU聚类：USEARCH（97%相似度）  

3.物种注释：SILVA数据库比对（置信度≥80%）  

4.多样性分析：  

Alpha多样性：Shannon指数（群落丰富度）、Simpson指数（群落均匀度）  

Beta多样性：PCoA分析（基于Bray-Curtis距离）  

四、质量控制与结果验证  

1.关键质控指标  

质控项目要求  

阴性对照无目标条带扩增  

DNA浓度≥20ng/μL（Qubit定量）  

测序深度≥30,000reads/sample  

2.结果验证方法  

qPCR定量：16SrRNA基因拷贝数验证（引物338F/518R）  

可培养验证：平板计数法（如石油降解菌数量与测序结果相关性分析）  

五、实战案例：石油污染场地微生物修复评估  

1.背景  

某加油站泄漏场地，TPH浓度5200mg/kg，修复前后微生物群落变化分析  

2.关键结果  

指标修复前修复后  

优势菌门变形菌门（32%）、放线菌门（28%）变形菌门（58%）、拟杆菌门（22%）  

功能基因烷烃降解基因（alkB）丰度0.3‰alkB基因丰度2.1‰  

Alpha多样性Shannon指数4.2Shannon指数5.8  

3.结论  

微生物群落结构显著优化，降解功能基因富集，修复效果xian著  

六、中科检测技术优势  

1.全流程服务：从采样到数据分析一站式解决方案  

2.平台配置：IlluminaNovaSeq6000（支持宏基因组/宏转录组联合分析）  

3.数据库支持：自建污染场地微生物参考数据库（含10万+菌株信息）  

附录：常用试剂与仪器清单  

测序引物合成（生工生物）  

高通量测序平台（IlluminaMiSeq）  

数据分析软件（QIIME2、R语言vegan包）  

注：本指南适用于污染场地修复评估、土壤健康评价等场景，检测周期建议7-10个工作日（含测序与分析）。